立式高壓滅菌器進行殺菌工作前，需要將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。一般來說每次滅菌前都應該加水。加水不能太少，否則會引起燒干或者爆裂，加水加去離子水或蒸餾水，這樣產生的水垢少些，而且鍋體不容易被腐蝕。

　　之后放回滅菌器滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

　　用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣*排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當立式高壓滅菌器內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間在溫度或者壓力達到所需時，需要切斷電源，停止加熱。當溫度下降時，再開啟電源開始加熱，使溫度維持在恒定的范圍之內。

　　待到滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，10分鐘后取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的液體由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。將準備滅菌的培養基及空玻璃器皿用牛皮紙包好，裝入鍋內套層中，物品放置不宜過多，過擠，鍋內應留出三分之一空間。然后蓋嚴鍋蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，關閉儀器蓋上的氣閥。